摘要
本文基于光学手段，开发出了一套能够兼顾可见光与近红外二区（NIR-II）窗口的双通道宏观成像系统，能够实时输出具有NIR-II荧光信息的高质量明场图像，解决了常规的NIR-II宏观成像系统提供的荧光图像与明场图像割裂较大的问题。实验中利用不同厚度的脂肪组织测试了吲哚菁绿的NIR-II窗口荧光信号分别在1 100~1 700 nm长通滤光片与1 300~1 700 nm长通滤光片下的抗散射能力与成像表现。接着利用所搭建的双通道宏观成像系统分别在小鼠以及大鼠模型上实现了淋巴结成像并模拟进行了淋巴结的切除手术，模拟了对腹腔淋巴结清扫的过程。最后，在大鼠模型上添加了不同厚度的生物脂肪组织，模拟实际手术中脂肪组织覆盖在淋巴结上的情况，观察双通道系统的穿透能力。可见近红外二区双通道荧光成像系统通过给操作者提供直观的影像信息，缩减手术时间、提高患者的预后，在临床手术导航中具有较大的应用潜力。
目前，根治性切除、器官移植等手术是治愈癌症的最主要手
随着研究者对近红外二区（NIR-II， 900~1 880 nm）窗口更加深入的认识，具有低散射、低生物自发荧光以及适度吸收的NIR-II成像窗口愈发受到生命科学与临床医学等多个领域的青
武汉大学洪学传教授团队在2017年利用NIR-II窗口宏观成像系统以及NIR-II探针在荷瘤小鼠模型上实现了对肿瘤边界的描绘，并且在NIR-II窗口宏观成像系统的引导下进行了相应的淋巴结切除手术，展现了NIR-II窗口在手术导航中的巨大潜
在本研究中，我们通过镜前分光的方式，首先搭建了兼顾可见光与NIR-II窗口的双通道宏观成像系统，通过光学方法克服了不同机位存在的视差问题，既可以捕捉到NIR-II探针的荧光图像，又能获得人眼看到的可见光图像，最终将两者进行实时融合后输出，帮助使用者通过一个界面能够直观得到病灶的边界信息与位置信息。本系统的处理速度快，输出帧数高（20帧每秒），可以直接适用于各种不同的应用场景。而中国科学院通过软件处理视差的系统中，近红外二区图像的帧数只有2帧每秒，并且在不同的使用场景下，需要对软件的融合算法做出不同的调整优化。为了确认本系统在未来临床领域的表现，我们选择临床广泛使用的吲哚菁绿（Indocyanine Green，ICG）作为荧光探针进行后续的验证实验，并利用搭建的双通道宏观成像系统跟踪记录了淋巴结切除手术的全过程。我们首先对ICG与血清的混合溶液进行了NIR-II窗口荧光光谱的测量，确保了ICG可以作为NIR-II窗口荧光探针使用。随后，我们利用不同厚度的脂肪组织测试了ICG的NIR-II窗口荧光信号分别在1 100 nm长通滤光片与1 300 nm长通滤光片下的抗散射能力与成像表现。后续为了进一步验证该系统能否在手术过程中提供良好的手术导航效果，我们利用所搭建的双通道宏观成像系统，分别在小鼠以及大鼠模型上实现了淋巴结成像并模拟进行了淋巴结的切除手术，模拟了对腹腔淋巴结清扫的过程。最后，我们在大鼠模型上添加了不同厚度的生物脂肪组织，模拟实际手术中脂肪组织覆盖在淋巴结上的情况，观察双通道系统的穿透能力。
硬件方面（如
图1 实时可见-近红外二区双通道宏观成像系统
Fig.1 Real-time visible-NIR-II dual-channel macroscopic imaging system
在双通道宏光成像系统辅助下的淋巴结切除手术中，我们选择临床通过FDA认证的ICG作为荧光探
为获取探针ICG的相关表征，我们配置了1%浓度的Intralipid作为生物组织模拟液，具体操作如下：
1.利用10% FBS溶液配置0.1 mg/mL的ICG血清溶液模拟ICG在体内同蛋白结合后的状态；
2.使用内径0.5 mm的毛细管吸取足量的ICG血清溶液，并裁去毛细管的多余部分置于内径3 cm的培养皿底部，利用UV胶将毛细管两端封口并固定于培养皿底部，保证毛细管内的ICG血清溶液不泄漏；
3.由于毛细管尺寸过小，原本NIR-II通道成像系统的放大倍数难以满足成像需求，利用C-mount延长环（CML05，Thorlabs，USA）增加镜头像方距离以提高放大倍数；
4.通过移液枪缓慢加入1%浓度的Intralipid，厚度每增加1 mm（0 ~5 mm），利用改造后的NIR-II通道成像系统在793 nm激发光照射进行记录。
首先我们通过对照USAF1951分辨率板（负片）进行了相关的分辨率测试（背板为近红外波段的LED光源），我们分别在可见光通道、NIR-II通道以及融合通道对USAF1951分辨率板（负片）进行了成像。
如
图2 （a） 可见光通道分辨率测试；（b） NIR-II通道分辨率测试；（c） 融合通道分辨率测试
Fig.2 （a） Visible light channel resolution test；（b） NIR-II channel resolution test；（c） Fusion channel resolution test.
由于现阶段高灵敏度的InGaAs相机的像元尺寸比较大，远大于发展相对比较成熟的可见光相机，因此在同样放大倍数的光学系统下，InGaAs相机所能提供的图像分辨率较低。经过校准融合后的画面如
目前，该可见光与NIR-II窗口荧光的双通道宏观成像系统足以捕捉到毫米级的荧光图像，并同时呈现相应的明场图像，足以运用于大部分宏观条件下的使用场景。随着InGaAs相机的研究和发展，在未来的工作中，我们会利用更高像素数、更小像元的相机，进一步优化系统，实现大视场、高分辨率的近红外二区荧光成
在中心波长793 nm的激光激发下，我们基于一款探测波段在900 ~2 200 nm的光纤光谱仪（NIR 2200， Ideaoptics Instruments，China）利用荧光光谱测量系统，测量到了10% FBS溶液中0.1 mg/ mL的ICG在NIR-II窗口的单光子荧光光谱如
图3 （a） 10% FBS溶液中ICG的NIR-II窗口荧光光谱；（b） 793 nm激光激发下的ICG（0.1 mg/mL，10% FBS）双通道融合图像，比例尺2 cm；（c） 在NIR-II区，不同厚度的1% Intralipid 下装有0.1 mg/mL ICG（10% FBS 溶液）的毛细管荧光图像；（d） 为相应的FWHM测量值，比例尺2 mm
Fig.3 （a） Fluorescence spectrum of indocyanine green （ICG） in 10% FBS solution in the NIR-II window；（b） Dual-channel fused image of ICG （0.1 mg/mL， 10% FBS） under 793 nm laser excitation， scale bar 2 cm；（c） Fluorescence image of capillary tubes containing 0.1 mg/mL ICG （10% FBS solution） under different thicknesses of 1% Intralipid in the NIR-II region；（d） Corresponding FWHM measurement values， scale bar 2 mm
可以发现即使在NIR-II窗口存在拖尾荧光，基本也集中在1 300 nm之前。我们选择1 100 nm以上荧光信号以及1 300 nm以上荧光信号进行对比测试。实验结果如
综合考虑，本系统采用的激发光中心波长为793 nm，生物组织在该处具有较低的光吸
对后肢两足垫注射75 μL 1mg/mL ICG，等待五分钟后，在793 nm激发光照射下，我们利用实时双通道宏观成像系统对小鼠进行皮下淋巴结成像（如图
图4 （a） 小鼠皮下淋巴结可见光通道图像； （b） 小鼠皮下淋巴结NIR-II通道图像，插图是对 （b） 中划线区域进行FWHM测量； （c） 未开腹前小鼠皮下淋巴结融合通道图像；（d） 小鼠开腹手术后的腹腔淋巴结融合成像. ①为腹腔内的淋巴结，②为与淋巴结相连的淋巴管，图像比例尺均为2cm。
Fig.4 （a） Visible light channel image of subcutaneous lymph nodes in mice；（b） NIR-II channel image of subcutaneous lymph nodes in mice， with an inset showing FWHM measurement in the region marked by the dashed line；（c） Fused channel image of subcutaneous lymph nodes in mice before laparotomy；（d） Fused imaging of abdominal lymph nodes in mice after laparotomy.① Represents lymph nodes in the abdominal cavity， ② Represents lymphatic vessels connected to the lymph nodes. Image scale bars are 2 cm for all images
接下来我们通过开腹手术，打开小鼠的腹腔，模拟在双通道宏观成像系统的支持下对腹腔淋巴结进行切除。待腹腔打开后，用PBS缓冲液简单洗去血渍后，挪开肠道等器官即可在双通道宏观成像系统中看到被ICG标记的腹腔淋巴结以及与其相连接的淋巴管（
实验动物为大鼠，基本操作与流程同前一小节相仿，对前肢、后肢足垫各注射250 μL 1 mg/mL ICG，等待五分钟后，在激发光照射下，我们利用实时双通道宏观成像系统对小鼠进行皮下淋巴结成像（如图
图5 大鼠皮下淋巴结成像： （a） 为腋窝淋巴结；（b） 为腹股沟淋巴结. 图像比例尺均为2 cm，左列为可见光通道，右列为融合通道图像
Fig.5 Subcutaneous lymph node imaging in rats：（a） Axillary lymph node；（b） Inguinal lymph node. Image scale bars are 2 cm， left column represents visible light channel， and right column represents fused channel images
我们通过开腹手术，打开大鼠的腹腔，模拟在双通道宏观成像系统的支持下对腹腔淋巴结的切除，并记录了整个手术过程，详见附件中的视频1，该视频为每秒20帧。打开腹腔之后，我们就能从融合画面中判断出被ICG标记的淋巴结的大体位置（
图6 （a） 为打开腹腔后的影像，左图蓝色虚线圆圈内为荧光通道指示区域； （b）为挪开遮挡器官、组织后的影像，左图蓝色虚线圆圈内为荧光通道指示区域； （c）为去除淋巴结上方的脂肪组织后得到的淋巴结影像，左图蓝色圆圈内为荧光通道指示区域；（d）为切除后的淋巴结影像。图像比例尺均为2 cm，左列为可见光通道，右列为融合通道图像
Fig.6 （a） Image after opening the abdominal cavity， with the blue dashed line circle indicating the fluorescence channel region； （b） Image after moving away the obstructing organs and tissues， with the blue dashed line circle indicating the fluorescence channel region； （c） Lymph node image obtained after removing the fat tissue above the lymph node， with the blue circle indicating the fluorescence channel region； （d） Image of the excised lymph node. Image scale bars are 2 cm， left column represents visible light channel， and right column represents fused channel images
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我们对照双通道绿色信号的位置，剥去附近的脂肪组织，两个腹腔内的淋巴结就清晰地显示出来了，如
在大动物乃至临床手术中可能出现较厚的脂肪组织覆盖在淋巴结上方的情况，导致淋巴结的寻找需要花费较多时间。为了模拟这一情况，我们在大鼠模型中采用不同厚度脂肪组织覆盖于淋巴结上方，并运用双通道宏观成像系统进行观察。
实验结果如
图7 从左至右依次为：（a） 无脂肪组织； （b） 2.5 mm厚脂肪组织； （c） 4 mm厚脂肪组织覆盖情况下的淋巴结影像，插图为脂肪组织厚度测量结果. 图像比例尺均为2 cm，均为融合通道图像
Fig.7 From left to right： （a） Lymph node image without fat tissue； （b） Lymph node image with 2.5 mm thick fat tissue； （c） Lymph node image with 4 mm thick fat tissue coverage， with an inset showing the measurement results of fat tissue thickness. Image scale bars are 2 cm， all are fused channel images.
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我们采用镜头前分光的方式搭建了一套能够同时进行可见光与NIR-II窗口荧光成像的双通道宏观成像系统，选取通过FDA认证的临床可用荧光探针ICG作为造影剂进行后续的实验。首先，我们通过体外的表征实验确认了所搭建的双通道宏观成像系统利用ICG在1 100 nm以上的荧光信号具备活体实时成像的能力。之后在双通道宏观成像系统的辅助下，我们分别在小鼠、大鼠模型上进行了皮下淋巴结成像以及腹腔淋巴结的切除手术。同时，我们利用不同厚度的脂肪组织模拟了一些复杂手术环境中可能存在的厚组织遮挡问题，证实了该系统对深层病灶的切除工作也具备一定的指导作用。本文中搭建的双通道系统能够兼顾明场与NIR-II荧光图像，具备（亚）毫米级的分辨率、3~5 mm的穿透深度，能够为使用者在癌症肿瘤切除、前哨淋巴结切除等开放性临床手术中提供实时的病灶影像支持，具有较大的临床手术使用潜力。
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